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细胞培养基大全

更新时间:2023-02-06      点击次数:1188

一、 细胞培养基的概念和原理



细胞培养基是人工模拟细胞在体内生长的营养环境,是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。培养液或培养基的含义几乎相同,英文都是medium。当它是粉剂时,倾向性地称为培养基,而将粉剂配成液体后,多称为培养液。培养液中常常补加血清、抗生素等成分。培养基主要包括天然细胞培养基、合成细胞培养基和无血清细胞培养基等。



天然细胞培养基是人们早期采用的细胞培养基,直接取自于动物组织提取液或体液,如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。营养价值高,但成分复杂,差异大、不稳定,来源也受到限制。水解乳蛋白和胶原是两种较好的天然培养基,富含氨基酸。血清是天然培养基中有效和常用的培养基,但其组成成分复杂,其中一些成分与功能不明确。血清的来源有胎牛血清、小牛或成牛血清、马血清、鸡血清、羊血清及人血清,广泛应用的为胎牛血清和小牛血清。



合成细胞培养基是用化学成分明确的试剂配制的培养基,组分稳定,主要包括糖类、必需氨基酸、维生素、无机盐类等。自1950 年199 细胞培养基问世以来,合成细胞培养基发展至今已有几十种,除了沿用半个世纪的基础合成细胞培养基之外,近年来还出现了营养成分更加丰富的低血清细胞培养基。

由于细胞种类和培养条件不同,适宜的合成细胞培养基也不同,在动物细胞培养中常用基础细胞培养基有6~7 种,如BME、MEM、DMEM、HAM F12、PRMI1640、199 等。

由于天然培养基的一些营养成分不能被合成细胞培养基代替,因此一般需在合成细胞培养基中添加5%~10%的小牛血清。小牛血清的加入对细胞培养非常有效,但小牛血清的成分复杂,这对培养产物的分离纯化和检测会带来一定的不便,为减少小牛血清的影响,开发了营养成分更加丰富的低血清细胞培养基,可以将小牛血清的使用量降低到1~3%。



无血清细胞培养基(serum free medium, SFM)是指在使用中无需添加血清的细胞培养基,且其组成成分不含有任何动物组分。按照其组分分类,还可以分为无动物组分无血清细胞培养基和化学限定无血清细胞培养基,前者组分中可能含有某些植物来源成分,而后者由化学成分明确的组分组成。

其中,无动物组分无血清细胞培养基是目前在生物制药行业中应用广泛的,它提高了细胞培养的质量,避免了使用血清带来的麻烦。目前,已有多种无血清培养基上市,如杂交瘤细胞无血清培养基、CHO细胞无血清培养基、Vero细胞无血清培养基和NS0 细胞无血清培养基等。无血清培养基通常添加生长附加成分,如激素与生长因子、低分子营养成分和转铁蛋白等促细胞生长的附加成分,一般包括胰岛素、孕酮、硒...酸NA、腐胺、转铁蛋白等。



细胞培养基是细胞培养的基础,它为动物细胞的健康快速成长提供营养物质。所以只要用到细胞来制造生物技术产品,细胞培养基的重要作用就不可替代。

二、细胞培养基的种类与基本成分

2.1 天然培养基

天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基,如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期,体外培养细胞都是利用天然培养基。但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大,因此逐渐被合成培养基所替代。

2.1.1 小牛血清

用于细胞培养的血清主要是牛血清,培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。选择用牛血清培养细胞的原因主要是来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。小牛血清取自出生10~30 天的小牛;新牛血清取自出生24小时之内的新生牛;胎牛血清应取自剖腹产的胎牛。显然,胎牛血清是品质很高的,因为胎牛还未接触外界,血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。

牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的,但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。牛血清中含有丰富的细胞生长必须的营养成份,具有极为重要的功能。

1) 血清主要作用

(1) 提供基本营养物质:氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等,是细胞生长必须的物质。

(2) 提供激素和各种生长因子:胰岛素、肾上腺皮质激素(氢化可的   松、地塞米松)、类固醇激素(雌二醇、睾酮、孕酮)等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。

(3) 提供结合蛋白:结合蛋白作用是携带重要的低分子量物质,如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等,转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。

(4) 提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤,对培养中的细胞起到某些保护作用。

2) 优点和缺点

血清是非常复杂的混合物,成分多样,含有各种生理平衡的分子量差别很大的生物分子,有的对细胞生长有促进作用,如含有携带激素、矿物质、微量元素和脂类物质的转运蛋白等。血清能够提供细胞贴壁因子和扩散因子。血清中含有起稳定作用和解毒的因子,能够维持培养基的pH 值并抑制蛋白酶直接或间接的酶解。但是血清的加入也带来了很多问题:

(1) 血清的成份可能有几百种之多,目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚,尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识,这给研究工作带来许多困难;

(2) 血清都是批量生产,各批量之间差异很大,而且血清保存期至多一年,因此,要保证每批血清的相似性极为困难,从而使实验的标准化和连续性受到限制;

(3) 不能排除血清中含有易变物质,这被认为是“瓶中恶化"的原因之一。

(4) 对大多数细胞,在体内状态,血清不是它们接触的生理学液体,只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清,因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态,血清可能促进某些细胞的生长(成纤维细胞)同时抑制另一类细胞生长(表皮细胞)。

(5) 血清含一些对细胞产生毒性的物质,如多胺氧化酶,能与来自高度繁殖细胞的多胺反应(如精胺、亚精胺)形成有细胞毒性作用的聚精胺。补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长,甚至造成细胞死亡。

(6) 取材中可能带入支原体、病毒,对细胞产生潜在影响。

(7) 血清的使用使得实验和生产的标准化困难,其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产中分离纯化工作很难完成。

(8) 大规模生产中,血清来源越来越困难,价格昂贵,是构成生产成本的主要部分之一。

(9) 为了使与传染源相关的风险减少到很低,存在多个国家间限制进出口生物材料的国际法规。

2.1.2 水解乳蛋白

水解乳蛋白(Lactalbumin Hydrolysate )为乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物,含有丰富的氨基酸。既可用于细菌微生物培养,又可用于动物细胞培养。细胞培养中一般为0.5%水解乳蛋白(经平衡盐溶解)与合成培养基(如MEM)按1:1混合使用。

目前在生产中主要用于低鼠肾细胞等细胞的培养和维持。但是水解乳蛋白的使用也给生物制品的生产带来一定的风险。首先由于水解乳蛋白系或者制品带来风险。其次水解乳蛋白及含有动物组分培养基的使用,使生物制品下游处理变得复杂,这对于蛋白质药物显得更加重要。因为从动物细胞中生产生物药品,其面临的最大困难就是如何去除内源或同源蛋白。不确定的成分,像动物肽类物质的引入,势必会增加提取、分离、纯化的步骤,一方面使成本提高,另一方面也会影响生物制品的产量和质量。

2.2平衡盐溶液

平衡盐溶液(balanced salt solution,BSS )简称盐溶液,集缓冲液的缓冲能力、生理盐水的等渗性以及培养液的营养供应特点于一体,兼具维持渗透压、缓冲和调节溶液的酸碱度、同时供给细胞生存所必需的能量和无机离子成分的作用。各种BSS的缓冲系统有所不同,其中以Hank’s液和Earle’s液为例,它们主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Earle’s (2.2 g/L)中比在Hank’s (0.35 g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的pH值。Eagles液在空气水平的CO2 中,溶液会变碱,Hank’s液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用Earle’s液,。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用Hank’s液就可以了。

一些BSS含有的Ca2+、Mg2+是细胞膜的重要组成成分,同时参与许多重要的细胞功能活动。但它们有使细胞凝集的作用,在配制分散细胞的消化液和特殊用途的细胞洗涤时,宜采用Ca2+、Mg2+含量较低的Dulbecco液或无Ca2+、Mg2+的D-Hanks液,或者PBS液。

2.3基础培养基

2.3.1 概述

基础细胞培养基主要包括199、MEM、RPMI-1640、DMEM 、DMEM/F12等。主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。人工合成培养基使用时还需添加一定量的血清使细胞生长和繁殖

2.3.2 组成及作用

氨基酸:组成蛋白质的基本单位。不同的细胞对氨基酸的需求各异,但几种必需氨基酸细胞自身不能合成,必须依靠培养液提供,如组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等。其余非必需氨基酸,细胞可以自己合成,或通过转氨作用由其他物质转化而来。绝大部分细胞对谷氨酰胺有较高的要求,因为谷氨酰胺是作为能源

及碳源物质同时被细胞利用,是是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡,所以各种培养液中都含有较多的谷氨酰胺。细胞所能利用的氨基酸是L型同分异构体,D型氨基酸不能被利用。

维生素:维持细胞生长的一种生物活性物质,对细胞代谢有重大作用。它们在细胞中大多形成酶的辅基或辅酶,没有它们,酶便没有活性,代谢活动将无法进行。维生素分为水溶和脂溶两大类的培养液中直接采用ATP和fu酶A。

葡萄糖:大部分培养基都以葡萄糖作为能量来源之一。

无机盐:维持培养基渗透压平衡,参与细胞的代谢活动。主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+等。Na+是细胞外液中最主要的阳离子,对维持渗透压的恒定有决定性的作用。K+主要分布在细胞内液,细胞内K+对于激活某些酶是必需的,并在调节细胞内环境的酸碱平衡上也有极重要意义。Ca2+在细胞外液中的作用是将组织内部细胞之间相互粘着,在细胞内参与许多重要的细胞生理活动,如传导、参与肌肉细胞收缩等。在悬浮培养时,为了减少细胞的聚集和附着,要减少Ca2+的浓度。

Mg2+是构成细胞间质的重要成分,对于细胞间相互稳定结合有很重要的意义。磷的化合物对细胞物质代谢和生理功能调控有重要作用。

其他成分:肽、核苷、嘌呤等。可帮助细胞的克隆化培养及维持某些特殊细胞系的生长。

2.3.3 分类

2.4 低血清细胞培养基

2.4.1 概述

营养丰富的培养基是维持细胞活性及高密度生长的基础,营养缺乏容易引起细胞凋亡,新生牛血清中所含大部分营养成分可以通过化学成分明确的营养物质如氨基酸维生素等成分组合取代。低血清培养基营养成分大优于基础培养基,仅需添加1%~5%新生牛血清,而对细胞生长、增殖、形态、活性和功能没有影响甚至有所改善。

在国外低血清培养基早已有之,如Gibco等。但是他们的低血清培养基是在基础培养基中选择性的加入重组胰岛素(recombinant insulin)、人源转铁蛋白(human (holo) tran- sferrin)以及牛血清白蛋白等,有些还包含一些生长因子,这些重组蛋白和动物来源成分对生物制品的安全性有很大影响。成本低。

2.4.2 主要用途

2.4.3 应用案例

采用199(SLM)、MEM(SLM)和DMEM(SLM)低血清培养基分别培养Vero细胞、BHK21细胞和CHO细胞,新生牛血清用量可以从10%降至3%,减少新生牛血清使用批次和批间差的影响,减少生物制品纯化损失,减少由于不确定蛋白或者其它血清组分带来干扰和差异的风险,提高制品安全性。低血清培养基可以在方瓶、3L转瓶、15L 转瓶及生物反应器中培养细胞,在疫苗生产中可以达到低血清高密度的培养效果。

低血清培养基营养成分优于基础培养基,易使细胞增殖迅速,代谢旺盛,代谢产物对细胞有不良影响,易产生细胞老化脱落现象。因此需要适当增加换液次数,增加传代频率。获取同样的细胞量,用低血清培养基将比用传统培养基缩短近1/3 的时间,可提高生产效率。

采用199(SLM)低血清培养基培养Vero细胞分泌狂犬疫苗病毒,滴度明显高于采用199 培养基传统培养获得的滴度。采MEM(SLM)低血清培养基BHK21细胞,在本实验情况下12 代内细胞形态和致密度均优于MEM培养基传统培养情况,因而可以预期其产生的口蹄疫、甲肝等疫苗生产的病毒产量将提高。低血清培养基用于反应器Vero细胞狂犬疫苗的生产,实践证明效果良好。采DMEM(SLM)低血清培养基添加1%小牛血清在转瓶中培养CHO细胞生产EOP,可提高收液次数,每次收液表达量明显提高。

2.5无血清细胞培养基

2.5.1 概述

无血清培养基是用来在无血清条件下生长特殊类型的细胞或进行专门应用的培养基。一般是由基础培养基和替代血清的补充因子组成。无血清培养基中没有添加血清,但含有个别蛋白或大量蛋白组分。无血清培养基与无蛋白培养基的区别在于培养基中没有添加蛋白,但含有一些动物或植物来源成分,如低分子量肽的水解物。还有一种化学限定培养基,培养基中不含有蛋白、水解产物或未知结构的组分,所有成分均有已知的化学结构。

优点:

1) 未知组分少;

2) 培养基中不存在血清中的抗体、补体等成分,对培养细胞影响小;

3) 杂蛋白含量少,生产的产品后期处理较容易,例如疫苗生产由于人用疫苗需要纯化减少杂蛋白,纯化过程中成本消耗很大,疫苗的损失也很大;

4) 无血清培养既可以实现细胞的大规模悬浮培养,增加培养液的利用率,可以采用发酵罐培养减少了人力消耗。

缺点:

目前为止不是所有的细胞都能在无血清培养基中培养。无血清培养基的某些组分价格昂贵,导致无血清无法工业推广的主要原因

2.5.2 无动物组分无血清细胞培养基的应用

三、细胞培养基的质量标准和检测方法

3.1细胞培养基的质量标准

3.2细胞培养基的检测方法

3.2.1 澄清度

水是细胞培养基的溶剂。细胞培养基中的营养成分只有溶解于水才能被细胞吸收摄取,细胞才能生长增殖,因此细胞培养基是否溶解以及培养液是否透明澄清直接影响培养基使用。该项目是通过对水溶解后的细胞培养基的澄清度检查,判断细胞培养基的澄清度。 按中华人民共和国药典2005年版二部附录Ⅸ B进行。

3.2.2 pH 值

哺乳类动物细胞生长需要合适的酸碱度,pH过高或者过低都会导致细胞死亡。pH值的测定也可以检查细胞培养基的批间差。清大天一标准规定取规定量供试品,用注射用水(水温20℃-30℃)溶解至1L,加入规定量碳酸氢钠到上述溶液中,用与细胞培养基溶液pH值相近的两点标准缓冲液校准后的酸度计进行测定。按中华人民共和国药典2005年版二部附录Ⅵ H进行;加入规定量的碳酸氢钠到上述溶液中,按中华人民共和国药典2005年版二部附录Ⅵ H进行

3.2.3 干燥减量的质量分数

细胞培养基具有吸湿性,在空气中放置水分会很快升高,干燥减量的质量分数表示产品中含湿量。细胞培养基是有菌制剂,其丰富的营养成分有利于微生物生长,控制细胞培养基中的水分可以防止微生物的繁殖,保持细胞培养基的养分。按中华人民共和国药典2005 年版二部附录Ⅷ L 干燥失重测定法进行。

3.2.4 渗透压

溶剂通过半透膜由低浓度向高浓度溶液扩散的现象称为渗透,阻止渗透所需施加的压力,称为渗透压。细胞必须生活在等渗环境中,动物细胞借助K+、Na+维持渗透平衡。大多数细胞对渗透压有一定的耐受性。但是培养液渗透压过高容易使细胞脱水wei缩,培养液渗透压过低容易使细胞膨胀破裂,因此要控制培养基的渗透压范围。按中华人民共和国药典2005 年版二部附录Ⅸ G 渗透压摩尔浓度测定法进行。

3.2.5 细菌内毒素

细菌内毒素是许多病原性细菌所产生的毒素。它的特殊性在于不是细菌或细菌的代谢产物,而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有生物活性的物质。培养基细菌内毒素过高,对生物制品疫苗(如狂犬、乙肝疫苗)、基因工程药品等注射用的药品都需要检查细菌内毒素。 因此本项目的检验符合生物制品质量控制要求。常规细胞培养基的细菌内毒素标准定为<10 EU/ml。称取本品规定量(见表4-12)的1/100,加入细菌内毒素检查用水10 mL溶解,吸取该溶液0.1 mL加细菌内毒素检查用水3.9 mL,混匀即得试样。按中华人民共和国药典2005 年版二部附录Ⅺ E 细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。

3.2.6 微生物限度

细胞培养基不是无菌产品,其中的微生物在一定条件下会吸收细胞培养基中的营养物质滋生繁殖,导致细胞培养基变质失效。控制细胞培养基中细菌和霉菌,是延长细胞培养基有效期的方法之一。清大天一在参考《中华人民共和国药典》2005版二部附录第100页的口服给药制剂的微生物限度标准,并严于该标准,规定细胞培养基产品的细菌数每1g不得超过200个,霉菌数每1g不得超过50个。

称取样品1 g,加入无菌纯化水10 mL溶解,混匀即得试样。按中华人民共和国药典2005年版二部附录Ⅺ J 微生物限度检查法进行,检查项目为细菌数、霉菌数。检查法采用平皿法。

3.2.7 细胞生长试验

这是一个性能特性表述的要求。细胞培养基的功能就是培养哺乳类动物细胞,因此经过细胞培养效果的检验是产品质量优劣的直观表述,这也是很多生物制药用户要求的一项指标。目前国内尚无细胞培养和计数的法定方法,可参考《体外培养的原理与技术》中细胞计数法中论述的内容给出。按产品说明书配制培养液进行细胞培养,前四天用含10%小牛血清的培养液培养,观察细胞形态并计数,检查细胞培养基是否有促生长的能力。后三天用不含小牛血清的培养液维持培养,观察细胞形态并计数,检查细胞培养基中是否有不利细胞生长的毒素。本试验用细胞为VERO细胞。

四、细胞培养基的使用方法

细胞培养基的种类繁多,细胞培养方式也较多,如何正确地使用培养基及很大程度地保持培养基的营养以维持细胞的生长,对每个培养者都很重要。培养基的使用依不同的培养基种类、培养方式、细胞种类的不同而存在差异。

4.1 细胞培养液的构成

细胞培养液指细胞生长的液体环境,一般指培养液,添加了血清、水解乳蛋白、各种添加剂等可以直接使用的培养液。

4.1.1 细胞培养基&血清模式

血清对于在传统培养基配方中生长和增殖的大多数细胞系来说是需要的,因为大多数单独的培养基并不能提供细胞生长所需要的全部营养,如MEM培养基,较为常用的量为5%~10%的比例,而特殊的低血清培养基血清量可降至3%左右,细胞的形态和功能不受影响。

4.1.2 细胞培养基&乳欧液模式

化学合成培养基现虽已大规模使用,但在某些培养领域水解乳蛋白仍在使用,以补充培养液中缺乏的氨基酸、小肽物质。较为常用的方式是用汉氏(Hanks’ BSS)或欧式(Earle’s BSS)平衡液溶解水解乳蛋白(一般为5‰浓度),即成乳汉(欧)液,再与化学合成培养基(一般为MEM)按比例混合使用(如1:1)。

4.1.3 细胞培养基&各类添加剂(生长因子等)模式

成分复杂的培养基还含有许多化合物,包括蛋白质、多肽、核苷、柠檬酸循环的中间产物、丙酮酸及脂类等。已发现当培养基中的血清浓度减少时,这些成分都是必需的。既使在使用血清的情况下,这些成分也可帮助细胞的克隆化培养及维持某些特殊细胞系的生长。激素和生长因子在大多数常规培养基的配方中都没有注明,但在无血清培养基中通常要加入它们,用其来代替血清中的激素能增加多种不同类型细胞的贴瓶率;生长因子包括FGF家族、EGF、PDGF、IGF-1和IGF-2及白介素等,生长因子和细胞因子有着广泛的特异性,一般与激素或其它物质起相互协同或加成作用。另一种常见的添加物就是血清替代物,目前已有许多可替代传统培养液中血清成分的商业产品,其稳定性较好,但批次间仍有差别,产品的成分也不很确定。

4.2细胞培养基配制

4.2.1 干粉培养基原倍液的配制

1)配制过滤除菌的细胞培养基

(1) 阅读培养基使用说明,确定需要添加何种添加剂(如NaHCO3、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等)。

(2) 根据所需将培养基全部倒入一容器中,用少量注射用水(20℃~30℃)将袋内残留培养基洗下,并入容器。加注射用水至总体积的95%,轻微搅拌溶解。

(3) 加入规定量的碳酸氢钠及所要添加的物质。

(4) 轻微搅拌溶解,加注射用水至规定体积。

(5) 用1 mol / L 氢氧化钠溶液或 1 mol / L 盐酸溶液调pH至所需值。

(6) 用0.22 μm滤膜正压过滤除菌。

(7) 溶液应在2℃-8℃下避光保存。

具体使用方法参照培养基包装袋上的说明书。

2)配制可高压灭菌细胞培养基

(1) 根据所需将培养基全部倒入一容器中,用少量注射用水(20℃~30℃)将袋内残留培养基洗下,并入容器。加注射用水至总体积的95%,轻微搅拌溶解

(2) 在121℃、15psi下灭菌15分钟。

(3) 待溶液冷却至室温,加入无菌0.2 mol / L L-谷氨酰胺溶液规定体积、无菌7.5%(w/v)碳酸氢钠溶液规定体积,加注射用水(20℃~30℃)至规定体积,混匀。

(4) 如果必要,用1 mol / L 氢氧化钠溶液或 1 mol / L 盐酸溶液调pH至所需值。

(5) 溶液应在2℃-8℃下避光保存。

具体使用方法参照培养基包装袋上的说明书

4.2.2 注意事项

1) 细胞培养用水一般为三蒸水(经石英蒸馏器蒸馏)或超纯水,医药生产上一般为注射用水。

2) 建议尽量选择与所用量相匹配的包装一次使用,因为包装一旦打开,组分可能会变质或因受潮而结团。

3) 溶解干粉培养基时先加入终体积90%-95%的培养用水,添加剂加完后再补足。

4) 如需添加的组分较多时,某一组分溶解后,再添加另一组分。

5) 待培养基溶解后再加入碳酸氢钠,以免产生沉淀。

6) 所有成分溶解后,培养基应立即过滤或高压除菌,以免产生沉淀或有微生物污染。

7) 在过滤除菌时,一般情况下应调pH比所需值低0.1~0.2个单位,因过滤除菌后,pH值会升高约0.2。

8) 在细胞培养过程中,建议不加或加少量的抗生素,如血清的浓度较低则所加抗生素的量也要相应降低一些。

9) 建议用1 N HCl或1 N NaOH来调节培养基的pH,因为用碳酸氢钠来调对培养液的渗透压影响比较大。

4.3 培养基灭菌

培养基的灭菌方法主要有两种,高压除菌及0.22 um微孔滤膜过滤除菌。与过滤相比,高压灭菌的工作强度小,相对便宜,失败率低,但易造成营养成分的流失。

4.3.1 高压灭菌

某些培养基(如MEM)可进行高压灭菌,例如清大天一的MEM培养基中的MD605、MD609等。其中不含有L-谷氨酰胺和碳酸氢钠,可在高压灭菌后加入。另外可高压的谷氨酸盐(如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)可代替L-谷氨酰胺

为保证高压灭菌的效果,灭菌设备的验证很关键,可高压灭菌的培养基在121℃、15psi,15分钟的条件下可达到灭菌效果及营养成分的最小损失,因此不需将灭菌时间延长。

4.3.2 过滤灭菌

大多数培养基采用0.1~0.2 μm孔径的微孔滤膜进行过滤灭菌,并且已成为培养基除菌的发展方向,它可低限度地减少培养基的营养损失。

4.4 细胞培养液的储存

细胞培养液的储存条件一般为2-8℃、密闭、避光保存,但要注意如下几点:

1) 过滤后的培养液,即添加了血清、谷氨酰胺、抗生素等的培养液要尽快使用,一般在2-3周内使用完。培养液中的L-谷氨酰胺是不稳定的,不同温度L-谷氨酰胺的降解。

2) 灭菌后的未加L-谷氨酰胺等添加剂的培养基溶液,一般可在4℃保存6~9个月,也可冷冻保存,用时解冻

3) 高压除菌后的培养基应置4℃保存,不能因为其可耐受高温而忽略储存温度。

4) 添加某些生长因子、激素等添加物,可能会改变培养液的储存条件,比如温度、时间等方面的要求


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