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BioDigital·青| 可以兼容qPCR体系的dPCR平台

更新时间:2023-02-15      点击次数:936

新冠疫情爆发以来,荧光定量PCR(qPCR)的核酸检测已经成为新冠确诊的“金标准"。与免疫检测相比荧光定量PCR具有较高的灵敏度,检测窗口期较短,可以更早地确诊是否病毒感染。qPCR是如何实现新冠定量的?首先,从咽拭子/鼻拭子中抽提获得新冠的遗传物质RNA,然后通过qPCR仪定量出拭子中的RNA病毒载量,就可以确定是否是新冠感染者。

荧光定量PCR技术最主要的参数是扩增曲线的ct值,该值与被定量样本的浓度存在一定数学关系,在qPCR定量中样本的浓度对数值(log值)与扩增曲线的ct值呈线性关系,ct值越小,浓度越高。根据采用的定量数学模型的差异,qPCR的定量分为外标定量(外标法)和内标定量(内标法)两种。外标法是定量过程中需要使用一系列已知浓度的外标定量标准品(4-5个浓度梯度),与待检测的样本同时检测,通过标准曲线算出待检测的样本,该方法用的较多。内标定量指已知浓度的标准品(即定量内标,1个浓度),与待检测的样本在同一管内扩增检测,需要保证内标与检测样本的扩增效率一致,才能准确计算出待检样本的浓度。


qPCR外标定量(标准曲线法)

需要做标准品的梯度稀释,浪费5-10个反应孔做标准曲线,需同时扩增标准品和待检测的样本。

1)标准品和待检样本同时扩增,绘制标准曲线;

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图1.外标定量标准曲线绘制


2)数据分析

需要繁琐的数据整理,将待检样本的ct值代入标准品标准曲线计算出未知样本的浓度。

无论是外标定量,还是内标定量,qPCR技术的定量均需要采用已知浓度的标准品来实现未知浓度样本的定量。然而,在实际情况中标准品和待检样本的性质不会相同,很难保证待检样本和标准品的扩增效率达到一致。所以,qPCR定量的精准性会打折。尽管qPCR具有比免疫检测技术更高的灵敏度,从新冠疫情的检测过程中发现,qPCR技术需要做2-3次重复检测,也会有一些无症状感染者转阳的案例,都是因为qPCR技术的灵敏度相对较低导致的。


外标法

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内标法

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图2.荧光定量PCR定量方法


数字PCR技术(dPCR)是一种核酸绝对定量技术,将反应体系均匀分配至2万个独立的反应微孔中,每个单元包含0个、1个、个别有多个目标核酸分子,在每个反应单元中分别对样品进行扩增,扩增结束之后依据泊松分布原理对各个反应单元荧光信号进行分析,实现绝对定量。

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图3.数字PCR荧光信号

红黄蓝绿各代表不同的检测靶标,同一张芯片可以检测多种靶点


相比传统荧光定量PCR,数字PCR拥有高的检测灵敏度(是荧光定量PCR的100倍以上,降低了“漏检"风险)、特异性和精确性,并且无需标准品可实现定量,是真正的绝对定量技术。

数字PCR平台定量

1)无需标准品,只需扩增检测未知样本即可。

2)数据分析可视化的图片,无需数据统计,直接呈现待检样本的浓度(copies/μL)。

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qPCR和dPCR的差异主要在于是否需要分区检测。qPCR不需要分区检测,20μL反应体积中包含待检测的靶标分子和反应试剂,该反应体系置于200μL的PCR反应管中扩增检测信号;dPCR需要将20μL的反应体积(包含待检分子和反应试剂)分到2万多个体积只有1nL左右的微反应单元,实现数字化分割。数字PCR的分区扩增提高了PCR检测灵敏度和精准性。

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表1.数字PCR与荧光PCR对比


那么,如何将qPCR体系转移到dPCR平台,实现PCR检测结果的精准性和灵敏度?从检测原理上看dPCR的分区扩增保证了PCR检测的灵敏度和精准性,而qPCR可以通过加大待检样本的体积来提高检测的灵敏度和特异性,但是这种方法提高的灵敏度和特异性是有限的。目前,qPCR已经有大量成熟的检测试剂盒(包括科研、医疗等),而dPCR技术具有更高的检测灵敏度和精准性,如果把目前qPCR检测体系转移到dPCR平台就可以更快地实现PCR检测的灵敏度和精准性。

实现该方法的转移需要满足3个条件:

1)qPCR试剂盒发光原理和dPCR检测的原理一样;

2)dPCR平台开放,兼容第三方的试剂盒或者试剂;

3)适度的体系优化即可实现精准定量。

qPCR体系转移到dPCR平台会带来2大优势:

1)不需要标准品,既可实现绝对定量;

2)提高了qPCR试剂盒检测的灵敏度和精准性。


BioDigital数字PCR“三明治"芯片,采用玻璃基底的微流控技术实现样本的稳定分区,保证了每个液滴的独立性和稳定性,具有更高的检测灵敏度和准确性。另外,BioDigital数字PCR平台具有很好的开放性,支持第三方qPCR试剂盒或试剂的转移,通过一步简单的体系优化甚至不需要优化的情况下,qPCR试剂盒就可以在BioDigital平台上实现精准的定量。


#案例一

小海龟科技BioDigital数字PCR平台兼容性测试——兼容客户自由的试剂盒、平台开放

测试内容:使用A客户自有体系(包括检测缓冲液、引物探针和模板)搭配小海龟数字PCR平台进行测试;

测试目的:使用客户成熟的荧光定量/数字PCR检测体系,测试其与小海龟数字PCR平台的兼容性,协助客户将检测体系迁移至我们的平台,节省体系重新开发的成本;

测试结果:重复8次测试(包括阴性和阳性),平均有效液滴数19000+,表明客户体系与小海龟数字PCR平台可兼容,液滴生成未受影响;下图为测试结果(原始图和一维散点图),结果表明数字PCR腔室分割正常,阳性液滴分布均匀,一维散点图阴阳性界限明显。

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#案例二

小海龟科技多重荧光、低检出限、梯度稀释验证

测试内容:使用小海龟数字PCR通用试剂盒,结合B客户自建的检测体系(引物探针)对小海龟数字PCR平台进行测试验证;

测试目的:测试B客户自建体系与平台的兼容性,并验证平台检测性能(线性、低检出限等);

测试结果:客户自建引物探针体系可兼容小海龟数字PCR平台,多重PCR体系阴阳性分簇良好。根据测试结果,小海龟数字PCR平台在1-1000copies/μL浓度范围内线性度佳(R2=0.999947),低检出限可达1copies/μL。

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#案例三

核酸标准品定值

测试内容:使用C客户自建体系,结合小海龟数字PCR通用试剂盒,对客户提供的核酸标准品进行定值;

测试结果:客户自建体系可适配小海龟数字PCR平台,通过多次重复测试得出待测标准品浓度为2697.83±46.70copies/μL。

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小海龟科技BioDigital•青 数字PCR检测服务

1)科研服务

拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究、二代测序文库定量/结果验证、LncRNA/circRNA表达分析、单细胞基因表达分析(注:客户已经自建qPCR引物探针体系)

2)肿瘤基因检测

已开发40余款BioDigital数字PCR液态活检试剂盒

3)工业客户服务

标准品定值、病毒载体定量

BioDigital•青 数字PCR检测报告(部分数据展示)

BioDigital•青数字PCR检测报告展示芯片荧光信号图、1D散点图和样本的拷贝数浓度


样本

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NTC

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表2.检测结果,软件直接呈现检测样本的浓度

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