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abcam原装抗体WB问题超全总结详解无信号,多条带,高背景等难题 |靶点解惑

更新时间:2023-05-09      点击次数:1116

蛋白免疫印迹(WB)是利用聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测特定样品或提取物中某种特定蛋白的方法。聚丙烯酰胺凝胶紧贴着膜放置,常用的膜是硝酸纤维素或PVDF(聚偏乙烯氟化物),在电流的作用下蛋白质从凝胶迁移到膜上并且被固定。膜是凝胶蛋白质的复制品,然后可以与抗体结合后进行染色。免疫印迹(WB)是一项通过凝胶电泳按照分子量大小分离蛋白,然后再利用特异性抗体识别这些蛋白的技术。它是对蛋白进行定性和相对定量的重要检测工具。

您在WB实验时是否遇到无信号、高背景、多带等问题?小编接下来将一一为您呈现这些问题的常见原因和解决方案

Chapter1



无信号常见原因和解决方案


WB实验时出现无信号或信号弱现象,小艾归纳整理发现,主要是靶标自身特性和WB实验流程中的样本制备、转膜、封闭、抗体孵育、洗膜和检测等具体实验细节问题会导致这一现象。接下来小艾跟大家详细扒一扒具体细节有哪些。

1.靶点特性导致无信号的常见原因及解决方案


▼ 组织或细胞中靶标蛋白含量低导致无信号或信号弱


可通过如下建议解决:


参考文献或数据库数据(例如The Human Protein Atlas)等,确认靶标蛋白是否在待检组织或细胞中表达。我们总结了41个有表达特异性的热门靶标表达信息,供大家参考(附录1)。


增加上样量,至少上样20-30μg蛋白。


浓缩使信号大化(例如检测核蛋白要用核裂解物;检测膜蛋白用膜裂解液,超速离心分离膜蛋白)。我们总结了58个热门靶标亚细胞定位信息,及其阳性对照供大家参考(附录2)。


参考文献或产品说明书,诱导增加靶标蛋白表达。很多靶标蛋白需要药物诱导或其它特殊处理,其含量才能达到WB检测范围,我们整理了17个热门靶标蛋白在不同细胞系中药物处理信息,及对应产品供大家参考(附录3)。


选择确认表达靶标蛋白的样本作为阳性对照(可参考产品说明书中提供的阳性对照)。


附录1 热门靶标蛋白表达及阳性对照

靶标名称

组织/细胞表达特异性(Uniprot)

Alpha-synuclein

•Alpha-synuclein主要在大脑中表达,在中枢神经系统的突触前末梢高度表达。

•在除肝脏外的组织中也有少量表达。

BDNF

•BDNF在海马、杏仁核、大脑皮层和小脑等脑组织中高度表达。

•BDNF也表达于心脏、肺、骨骼肌、睾丸、前列腺和胎盘中。

Caspase-3 /cleaved Caspase-3

•在肺、脾、心脏、肝脏和肾脏中高度表达。

•脑和骨骼肌内中水平表达,睾丸低水平表达。

•在许多细胞系中表达,在免疫系统细胞中的表达最高。

点击此处查看更多热门靶标组织/细胞表达特异性


附录2 热门靶标蛋白亚细胞定位及阳性对照

靶标名称

蛋白亚细胞定位(Uniprot)

阳性对照

Alpha-synuclein

细胞膜,细胞质,细胞核;也分泌于细胞连接、突触和多巴胺能神经元膜结合处。

•WB:HAP1、HEK293-T细胞裂解液 ;人、大鼠脑组织裂解液 ;重组人Alpha-synuclein蛋白(ab51189 。

BDNF

分泌型

•WB:重组人/小鼠/大鼠BDNF蛋白(ab9794) ;人,大鼠和小鼠的脑,海马和小脑组织裂解液

BrdU

细胞核

•IHC:来自BrdU 处理的小鼠的未染色切片(ab129956)。

 •ICC:BrdU处理的HeLa 细胞。



附录3 热门靶标蛋白阳性对照及药物处理条件


靶标名称

细胞系

试剂处理

产品

c-Fos

HeLa

血清饥饿36小时,20% FBS(2小时)

ab214672

Jurkat

血清饥饿过夜,PMA(200 nM, 4 小时)

RAW 264.7

血清饥饿过夜,PMA(200 nM, 4 小时)

Cleaved Caspase-3

HAP1

星形孢菌素(2 μM, 24小时)

ab32042

HeLa

星形孢菌素(2 μM, 24小时)

cleaved N-terminal DFNA5 / GSDME

SH-SY5Y

Etoposide(60 μM ,14小时)

ab222408

点击此处查看更多热门靶标蛋白阳性对照及药物处理条件


▼组织或细胞中修饰后(磷酸化、乙酰化和泛素化等)的靶标蛋白含量底,可导致无信号或信号弱现象

可通过如下建议解决:


通常情况下,在未处理的组织或细胞中,大部分翻译后修饰状态下的蛋白含量较少。


参考文献或产品说明书,诱导增加靶标蛋白含量。我们整理了25个热门靶标,在不同细胞系中检测其翻译后修饰形式,需药物处理条件及对应的产品,供大家参考(附录3)。


裂解缓冲液中使用相应去修饰酶抑制剂。(例如靶蛋白磷酸化检测,裂解液中需增加磷酸酶抑制剂)


阳性对照(参考产品说明书中诱导试剂和条件,处理样本。)


附录3 翻译后修饰靶标蛋白阳性对照及药物处理条件

靶标名称

细胞系

试剂处理

产品

eNOS(phospho S1177)

HUVEC

Pervanadate(100 uM,10分钟)

ab215717

JAK2(phospho Y1007 + Y1008)

Jurkat

Pervanadate(50 mM ,5分钟)

ab32101

C6 

Pervanadate(50 mM,5分钟)

Hepa1-6

Pervanadate(100 µM,30分钟)

MEF

Pervanadate(100 µM,30分钟)

MLKL(phospho S345)

L-929

20 ng/ml TNF alpha,100 nM Smac mimetic和20 µM z-VAD(8小时)

ab196436

点击此处查看更多翻译后修饰靶标蛋白阳性对照及药物处理条件

注:具体细胞系处理信息请参考产品说明书


▼靶标蛋白是分泌型蛋白,检测时分泌到细胞外,若检测的样本为全细胞裂解液,会出现无信号或信号弱现象

可通过如下建议解决:


使用 Brefeldin A(BFA)抑制蛋白分泌,提取全细胞裂解液。


如果全细胞裂解液中检测不到靶蛋白,建议提取细胞培养上清中的蛋白。




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